sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(只读本文就能搞懂)

【实验目的】

(1)掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理。

(2)掌握用SDS-PAGE检测蛋白质的方法及操作过程。

【实验原理】

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠)。1967年,Shapiro等人首先发现,如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小。

SDS是1种阴离子型去垢剂,带负电荷。因此,蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时,可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,使蛋白质本身带有的电荷被掩盖,起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小,从而达到分离目的蛋白的目的。同时,SDS-PAGE可以测定蛋白质的相对分子质量。当蛋白质的相对分子质量在15000~200000时,样品的迁移率与其相对分子质量的对数呈线性关系,符合以下方程式:

lg Mr=-b×mR+K

式中,Mr为蛋白质的相对分子质量;

mR为相对迁移率;

b为斜率;

K为截距。当条件一定时,b与K均为常数。

因此,通过已知相对分子质量的蛋白与未知蛋白的迁移率比较,就可以得出未知蛋白的相对分子质量。

【实验材料、试剂及仪器】

1.实验材料

实验31获得的经不同时间诱导的大肠杆菌。

2.实验试剂

(1)30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺29g,N,N′-亚甲基双丙烯酰胺1g,溶于60mL水中,加热至37℃溶解,定容到100mL,用0.45μm滤膜过滤,室温避光保存。

(3)分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)。称取Tris36.3g,溶于200mL蒸馏水中,用浓盐酸调pH至8.8。

(4)浓缩胶缓冲液:1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)。称取Tris12.1g,溶于200mL蒸馏水中,用浓盐酸调pH至6.8。

(5)10%过硫酸铵溶液:过硫酸铵1g加蒸馏水水定容到10mL,4℃下可贮存1周,但最好现配现用。

(6)四甲基乙二胺(TEMED)。

(7)10%(m/V)SDS溶液:称取10g SDS于100mL蒸馏水中,微热使其溶解。贮存液保存于室温,用前微热,使SDS完全溶解。

(8)5×Tris-glycine电泳缓冲液:称取Tris15.1g,甘氨酸94g,10%SDS50mL,加蒸馏水定容至1000mL。

(9)1mol/L DTT溶液:20mL0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)中溶解3.09g二硫苏糖醇(dithiothreitol, DDT),过滤除菌后分装成1mL每份,-20℃贮存。

(10)2×SDS凝胶上样缓冲液:100mmol/L Tris-HCl(pH6.8),200mmol/L DTT(不含DTT的凝胶加样缓冲液800μL+1mol/L DTT200μL。DTT现用现加。),4%SDS,0.2%溴酚蓝,20%甘油。

(11)染色液:称取考马斯亮蓝R2500.25g,溶于90mL蒸馏水中,加甲醇90mL,再加入冰乙酸10mL,搅拌使之充分溶解,必要时滤去颗粒状物质。

(12)脱色液:甲醇/冰乙酸/水(V∶V∶V=3∶1∶6)。

(13)蛋白质分子大小标准参照物。

3.实验仪器

SDS-PAGE装置(每4人1套)

微量移液器(每2人1套)

高速离心机(每4人1台)

恒温摇床(全班1台)

-20℃冰箱(全班1台)

恒温水浴锅(每4人1台)

高压灭菌锅(全班1台)

电子天平(每8人1台)

1.5mL离心管(若干)

各种规格吸头(若干)

【实验步骤】

1.SDS—聚丙烯酰胺凝胶的灌制

(1)根据说明书安装玻璃板。

(2)按表14.1所示配制10%分离胶溶液。

表14.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳10%分离胶溶液配制表

蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

(3迅速在两玻璃板的间隙中灌注10%分离胶溶液,留出灌浓缩胶 所需空间(梳子齿长+1cm),覆一层重蒸水(覆盖水层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应),将凝胶垂直放于室温下,大约20~40min后胶即聚合。

(4)倒出覆盖水层,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺后,尽可能排去凝胶上的液体,最后用滤纸条吸净残留液体。

(5)按下表所示配制5%浓缩胶(本实验配制2~3mL即可)。

表14.2 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液配制表

蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

(5)由于加入TEMED后浓缩胶马上开始聚合,故应在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,然后立即在浓缩胶中插入干净的梳子,此时应小心避免混入气泡,再加入浓缩胶以充满梳子之间的空隙,待浓缩胶凝聚(约30min)后,拔除梳子。用去离子水洗涤梳子数次以除去未聚合的丙烯酰胺,并用滤纸条吸干残留液体。

2.样品的制备及电泳

(1)将1.5mL细菌培养液经10000r/min离心2min,收集菌体,存于-20℃冰箱中备用。将储存的菌沉淀样品+5μL蒸馏水+5μL2×SDS凝胶上样缓冲液在1个离心管中混合,100℃加热5min后,取出冷却至室温,12000r/min离心1min,取上清液。

(2)装好电泳系统,加入电泳缓冲液,上样8μL。

(3)将电泳装置与电源连接,在凝胶上加8V/cm电压,待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15V/cm继续电泳,直至溴酚蓝达到分离胶的底部。电泳过程约需80~150min。

(4)卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色过夜。加入脱色液,置于80r/min脱色摇床上,每20min更换1次脱色液至完全脱净。

(5)将脱色后的凝胶照相或干燥,也可用塑料袋密封在20%甘油水溶液中长期保存。

【典型实验结果分析】

理想实验结果(见图14.2,泳道3,4)含有外源基因的重组质粒的菌株经IPTG诱导后表达出目的蛋白片段。而不含重组质粒的菌株则不表达该蛋白片段。

蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

图14.2 大肠杆菌外源基因表达蛋白的SDS-PAGE结果

1:蛋白质分子大小标准参照物;2~3:表达蛋白样品;4:空白对照

【实验注意事项】

(1)实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

(2)为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的pH值要准确,10%AP在一周内使用。室温较低时,TEMED的量可加倍。

(3)未聚合的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。

(4)在“实验步骤”1中(2)、(4)配制溶液时,一旦加入TEMED,胶马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作

(5)【参考文献】

[1]杨安钢等.生物化学与分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,2008.

[2]梁宋平.生物化学与分子生物学实验教程.北京:高等教育出版社,2002.

[3]郭勇.现代生化技术.广州:华南理工大学出版社,2001.

[4]Boyer RF. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company Inc, 2000.

[5]Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR. Plasmid transformation of E. coli and other bacteria. Methods in Enzymology, 1991, 204: 63~113.

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